您现在的位置:首页 > >

氧化石墨烯荧光淬灭

发布时间:

1 我报告的题目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀/多肽复合焚光探针用于蛋白激酶活性及抑制作 用分析 2 蛋白激酶催化作用下的蛋白质憐酸化是生物体内翻译后修饰的重要方式之一。蛋白质的憐酸化和去 磷酸化这一可逆过程几调节着细胞的发育、增殖、分化、信号转导、神经活动、肌肉收缩、细胞凋亡 及肿瘤发生等过程在内的大部分生命活动。非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病,例如癌症或老 年痴呆症等。因此,准确灵敏地检测过度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄选高效抑制剂对于人 类一些重大疾病的早期诊断和治疗极为重要。 传统用于蛋白激酶活性分析的方法依赖于放射性元素标记伽马-32P-ATP 法,由于放射性物质对环境 及其人体的危害而随之被取代,基于憐酸特异性识别抗体的免疫技术[146]、突光分析方法表面等离子 共振技术[184,185]以及质谱等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。 石墨稀(Graphene),是从石墨材料中剥离出来的由碳原子组成的二维晶体, 是目前己知世界上强度最高的材料。石墨稀具有独特的电子、机械、热力学特性 在化学、质量、压力等传感应用中独具优势,。与碳纳米管相似,石墨烯对有机 荧光分子表现了有效的突光淬灭效果,这一过程中同时发生了激发态突光分子与 石墨烯表面之间的能量转移和电子转移。2010 年诺贝尔物理学奖 氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物,氧化石墨烯是单一的原子层,仍然具有淬灭 荧光的效果 3 本文首次提出了一种基于多肽/石墨烯突光浮灭机制和接肽酶降解作用的激 酶活性分析方法。酪蛋白激酶 CKII 是一种重要的丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶, 能磷酸化 160 种不同的蛋白质,我们以 CKII 为蛋白激酶模型 。FITC 标记的 CKII 底物多 肽,FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD),能与 GO 发生有效的突光浮灭。幾肽酶 CPY 是一类 肽链端解酶,作用于任何一个 C-末端残基,从肽链的 C 端开始逐个降解,释放出 游离氨基酸。FITC-peptide 在 CPY 的消化作用下释放出游离的 FITC 分子,在 高离子强度环境下,游离 FITC 分子与 GO 之间的吸附较小而保持相当强的焚光。 而当 FITC-peptide 在 CKII/ATP 催化发生磷酸化,有效地阻碍 CPY 在憐酸化丝氨 酸位点的降解,使得 FITC-多肽更容易与 GO 结合导致焚光淬灭。 1 羧肽酶 CPY 作用于任何一个 C-末端残基

逐个降解释放游离氨基酸,并释放出游离的 FITC 分子,在高离子强度环境下(猜想,故而加了氯化镁和钾),与 GO 之间吸附较小保持相 当强的荧光 4. 梭肽酶(carboxypeptidase Y, CPY)、Staurosporine、弗斯可林(Fskorlin)和 3-异丁基-1-甲基黄嘿呤(IBMX) 购买于西格玛公司(中国上海)。cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA,催化亚基)购买 于 Promega 公司,酷蛋白激酶 II (CKII)购买于 New England Biolabs 公司(美国)。 突光素标记底物多肽:FITC-RRRADDSDDDDD ( FITC-pep )、 FITC-RRRADDpSDDDDD (FITC-Ppep)和 FITC-LRRASLG (FITC-kemptide) ATP、蛋白酶抑 制剂和改良型 Bradford 蛋白总浓度检测试剂盒 牛血清蛋白(BSA)、三轻甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、 EDTASynergy Mx 酶标仪(BioTek 仪器有限公司)进行突光光谱分析,所有样 品用 480 nm 作为激发波长,从 500 nm 到 700 nm (25 °C)扫描焚光发射谱图。 5 氧 化 石 墨 稀 与 多 肽 FITC-pep 之 间 的 劳 光 淬 灭 ( 氧 化 石 墨 烯 对 荧 光 强 度 的 影 响 ) FlTC-peptide+ TBS+ Tris-HCl+ MgCb+ KCl+氧化石墨稀 在 96 孔酶标板中加入 60 nL 浓度为的多肽(FlTC-peptide)溶液(溶 于 TBS,即 20 mM Tris-HCl,10 mM MgCb, 50 mM KCl, pH 7.5),每孔中加入

5 pL 氧化石墨稀(浓度 40 |ig ml/i),设定酶标仪混勻 1 min,在 480 nm 激发下 扫描 500 nm 至 700 nm 的突光发射光谱。考察氧化石墨烯的浓度因素时,加入石 墨稀的浓度依次为 0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mU'), 酶标仪设定程序同上。考察 FITC-peptide 的多肽片段对氧化石墨稀的亲和力时, 用游离的突光素 FITC 分子作为参照,与石墨稀在酶标板中混勻 1 min 后进行劳光 检测,程序同上。 6 氧化石墨稀(GO)与多肽之间通过亲疏水性、电子共辄、电荷吸附等发生 相互作用。氧化石墨稀(GO)含有亲水性的离子化边缘和疏水性的中间片层因而 具有两亲性,当突光染料标记的多肽与石墨烯共存时,由于亲疏水作用、电荷吸 附等作用而导致多肽结合在 GO 表面,荧光染料分子与 GO 发生较强的能量转移 而导致焚光萍灭。 当增加 GO 的浓度,FITC-peptide 在 520 nm 处的焚光强度随之剧烈降低,GO 浓度为 50 lag ml/i 时,FITC-peptide 劳光强度与 萍灭之前相比,下降至 15%,萍灭程度非常高。而游离的 FITC 分子在与 GO 混 合之后,随着 GO 浓度的增加,FITC 突光分子的焚光强度没有很明显的下降,当 GO 浓度为 50 i^g mL"'时,FITC 分子的突光仍保持了 90%,这说明 GO 对 FITC-peptide 突光浮灭作用要远远大于游离的 FITC 分子,同时多肽片段因为能很 好的与 GO 结合,导致了 FITC 更易于 GO 接*,发生电子传递的劳光浮灭 7 羧肽酶消化多肽底物(CPY 浓度对荧光强度影响) 100^lL 浓度为 10|iM 的多肽(FITC-peptide)溶液中,加入 3.29 U mL/i 的接 肽酶 CPY,恒温 25。(:孵育 30 min,取反应液 60 ^iL 与氧化石墨稀(浓度 40 ^ig ml/i) 在酶标板中混勻 1 min 后进行劳光检测,程序同上。考察梭肽酶 CPY 对憐酸化多 肽(FITC-Ppep)的消化作用时,釆用同样浓度的 FITC-Ppep 多肽(10 ^M)与 CPY 作用,然后与石墨稀混合测突光发射光谱。考察接肽酶 CPY 对此浓度的多 肽的消化所需量时,在多肽溶液中加入 CPY 的浓度为:0-13.16UmL 人其余条 件一致。FITC-peptide/FITC-Ppep+CPY+氧化石墨稀+其余条件 8 检测 PKA 活性和抑制作用(研究不同激酶活性,激酶浓度的影响。CKII 中加抑制剂浓度 的影响)蛋白激酶 CKII 催化的憐酸化反应条件为:含有 10^iM 多肽(FITC-pep)、0.1 mMATP、10 U CKII、20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCb, 50 mM KCl 的反应混合 液(pH7.5)在恒温 30 °C 反应 1 小时。蛋白激酶 PKA 催化的磷酸化反应条件为: 10^1 肘多肽(FITC-kemptide)、0.1 mMATP、10 U PKA、50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCh 的反应混合液(pH7.5)在恒温 30 °C 反应 1 小时。激酶催化憐酸化反应完 成后,取 100 反应混合溶液,加入 3.29 U 的接肽酶 CPY,恒温 25 °C 孵 育 30 min,再取 60 |iL CPY 消化后的反应液与氧化石墨烯(浓度 40 |_ig ml/i)在 酶标板中混匀 1 min 后进行突光检测,程序同上。 分析蛋白激酶 CKII 的活性实验中,120 ^;!^憐酸化反应液中加入不同浓度的 激酶,即 0-100 U。考察 Staurosporine 或 H-89 对激酶 CKII 的抑制效果时,在激 酶催化磷酸化反应时,加入 lOUCKII,同时加入不同浓度的 Staurosporine (0 - 20 I^M)或 H-89 (0 - 0.2 mM). 9 了两种广谱小分子抑制剂:Staurosporine、 H-89 来进行考察。在 CKII 催化憐酸化反应缓冲液中,加入一系列浓度的激酶抑 制剂 Staurosporine 或 H-89,反应完成后,加入 CPY 消化,然后与 GO 结合之后 检测突光强度,实验结果见图 5.12。如图 5.12A 所示,随着 Staurosporine 浓度的 增加(0 - 20 ^M),多肽/GO 复合物的突光依次增加,这表明 Staurosporine 对激 酶 CKII 活性有很好的抑制作用,当 Staurosporine 的浓度达 5 |aM 时,抑制作用达

到最强。从焚光强度对 Staurosporine 浓度的对数关系图得到 Staurosporine 的抑制 曲线,可以估算出 Staurosporine 对 CKII 的 ICso 值(最大抑制的 50%对应的浓度) 为 94nM,这与以往文献报道值接*[2°4]。另一方面,H-89 对 CKII 活性的抑制作 用在图 5.12B 中体现,在激酶催化憐酸化反应中,改变抑制剂 H-89 的浓度(0 - 200 HM),随着 H-89 浓度旳增加,多肽/GO 复合物的焚光强度也依次增加,这表明生物纳米材料构 建蛋白激酶活性传感与蛋白质直接电化学 H-89 对激酶 CKII 催化反应的抑制,相应的憐酸化水*逐步降低。通过焚光强度 对 H-89 浓度对数关系作图,得到 H-89 的抑制曲线。可以估算出 H-89 对 CKII 的 IC50 值是 1.18 laM,这与以往文献中报道值相当比较 Staurosporine 和 H-89 对 CKII 活性的抑制作用结果,我们发现两种小分子抑制剂对 CKII 的抑制能力是 不一样的,Staurosporine 的 ICso 值要明显小于 H-89 的,这说明 Staurosporine 的 抑制能力更强。因此,上述结果证实了我们提出的这种基于 CPY 消化作用及 GO 突光萍灭作用的激酶活性分析方法,不仅能有效检测小分子抑制剂,而且能用于 蹄选激酶抑制剂。 10MCF-7 细胞培养和裂解液的准备 MCF-7 细胞(一种乳腺癌细胞)(1 X 105 个细胞)培养在含有 10%的胎牛血清,转录非必需氨 基酸溶液(0.1 mM), 1%胰岛素-转铁因子-硒补充剂,青霉素(lOOUml/i),链霉 素(100mgmL_i),两性霉素 B (0.25 mgrnL"')的培养液中。细胞在包含 5%C02 的湿度氛围中孵育(37 °C)。用无血清培养基(ImL)代替细胞培养基在刺激之 前培养 4 小时,培养基中加入用二甲基亚砜(DMSO)配制的不同浓度的 Fosklin/IBMX(抑制细胞增殖)混合液(lOpL,Fosklin/IBMX 最终浓度在图 6A 插图中显示) 来激活细胞内的 PKA。DMSO (10 laL)代替 Fosklin/IBMX 添加到培养基作为未激活 样品。激活 30 分钟后,将细胞转移至憐酸盐缓冲液(D-PBS)中,通过超声(200 W)2 秒 X60 次,每次间隔 3 秒钟的方法超声破碎细胞。再将细胞裂解液在转速 22 000 rpm^ 4。C 下离心 60 分钟,取上清液备用。 使用改良型 Bradford 总蛋白浓度试剂盒来估算细胞裂解液的总蛋白浓度,其 用牛血清蛋白(BSA)作为标准。不同浓度的 BSA 标准溶液(5-30|agniI/i)和 Bradford 反应物孵育 10 分钟,用紫外-可见光谱得到该溶液在 595 nm 的吸光度, 标准浓度对吸光度的校正曲线通过线性关系得到。最后,将细胞提取物与 Bradford 反应试剂混合,用上述提到的方法检测。总蛋白浓度通过参照标准曲线计算。所 有细胞裂解液的总蛋白浓度稀释为 8 ml/i 用于激酶活性实验 11。FITC-多肽的突光萍灭程度用(Po-PyPo 来计算,/>0 为 FITC-多肽与 GO 结合之前的焚光强度,P 为 FITC-多肽与 GO 结合 后的突光强度。如图 5.14 所示,FITC-kemptide 在 1 号裂解样品参与的憐酸化下, 经 CPY 消化和 GO 的结合后,表现的突光萍灭程度最低((Po-P)/PQ = 0.52),随 着激活剂 Foskolin/IBMX 浓度的增加,FITC-多肽/GO 复合物的突光浮灭程度依次增加,当浓度 增加至第 5 号样品浓度值时(Ci:sk= 10 |iM,Cibmx = 20 ^iM),突光 浮灭程度达到最大((P()-P)/P() = 0.84),而再增加激活剂浓度,相应的劳光淬灭程 度反而有所下降。因此,我们提出的基于接肽酶 CPY 消化作用与氧化石墨稀突光 萍灭效应的蛋白激酶活性分析方法,能有效检测 MCF-7 细胞裂解液中激活 PKA 的活性,拓宽了此种分析方法在分析检测中的应用 而 CKII/ATP 催化磷酸化后,有效组织 CPY 在磷酸化丝氨酸位点降解,使得 FITC-多肽容易 与 GO 结合导致荧光淬灭 酪蛋白激酶 CKII 催化肽链中邻*酸性氨基酸残基的丝氨酸/苏氨酸磷酸化的酶

FITC 标记

Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂(或称去

污剂)

staurosporine 蛋白激酶 C(PKC)抑制剂
H-89 也称 H89,全称为 N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide· 2HCl hydrate,是一种常用的 PKA 抑制剂。H-89 可以通透细胞,可以选择性抑制 cAMP、cGMP 依赖的蛋白激酶 PKA、PKG 和 PKCμ,但对于 PKA 的选择性抑制作用更强。 H-89 分子量为 519.28,分子式为 C20H20BrN3O2S· 2HCl,CAS Number:127243-85-0。本产品纯度大于 98%。

CKII 酪蛋白激酶 II 蛋白激酶 C(PKC)是动物细胞内信号转导中重要的酶. 它是一族磷脂依赖的丝/苏氨酸激酶, Foskin 弗斯可林:毛喉鞘蕊花中所含的佛司可林为目前已知的最强的腺苷酸环化酶激活剂,能 够直接激动腺苷酸环化酶, 提高多种组织细胞中的环腺苷酸的浓度, 从而参与多种细胞功能 调节, 它还是人体形成重要激素过程中不可缺少的部分。 通过弗斯可林的作用可以降低血压, 抑制过敏性反应,以及能够促进甲状腺素的分泌。弗斯可林的其他功效同样显著,包括抑制 象由血小板激活因子(PAF)6 引起的炎症以及抑制癌细胞的扩散。 IBMX, 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤: cAMP 和 cGMP 磷酸二脂酶的非专一性抑制剂。IBMX 抑制了 磷酸二脂酶,cAMP 的增加激活了 PKA 蛋白激酶 A(英语:Protein kinase A) ,一类 cAMP依赖型酶 ,其结果是减少增殖,增加分化和诱发凋亡. IBMX 抑制由苯肾上腺素诱导的色胺 (来自于神经内分泌上皮细胞的减少粘液 IC50: 1.3 μM)的减少 。也作为腺苷受体拮抗剂。 ------IBMX 抑制 cAMP 间接抑制 PKA
肯普肽;英文名称:kemptide 因发现者肯普(Kemp)而得名。S6 激酶的底物肽(LRRASLG),可被磷酸化。

C32H61 N13 O9

Tris 氨基丁三醇为弱碱,在 25℃下,它的 pKa 为 8.1;根据缓冲理论,Tris 缓冲液的有效缓冲范围在 pH7.0 到 9.2 之间。Tris 碱的水溶液 pH 在 10.5 左右,一般加入盐酸以调节 pH 值至所需值,即可获 得该 pH 值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris 的 pKa 的影响。 DTT 即 DL-Dithiothreitol, 中文名为二硫苏糖醇。 分子式为 C4H10O2S2, 分子量为 154.25, 纯度>99%。 常用还原剂,有抗氧化作用,进口分装。DTT 和巯基乙醇相比,作用相似,但 DTT 的刺激性气 味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。而且 DTT 比巯基乙醇的浓度低 7 倍时,两者效果相*,但

DTT 价格略高一些。 在散布图中,通常还要用误差棒(error bar)注明所测量数据的不确定度的大小。 误差棒是以被测量的算术*均值为中点,在表示测量值大小的方向上画出的一个线段,线段长度的一 半等于(标准或扩展)不确定度。它表示被测量以某一概率(68%或 95%)落在棒上。图 1 表示不 同时期几个单位对牛顿万有引力常数的测量结果, 最下面的一个数据是国际科学技术委员会 2002 年 给出的推荐值。

SynergyMx 多功能酶标仪
Synergy
TM

Mx 多功能微孔板检测系统, 拥有独特的 Fine-Tuned

TM

技术, 在微孔板检测领域独树一帜。 Synergy

TM

Mx 采

用四光栅系统进行波长的选择,其波长重复性可精确到± 0.2nm,顶部探头可以 100 μ m 的步进精度自动精准聚焦。 Synergy
TM

Mx 的荧光检测采用了独特的带宽设计,激发和发射侧均可独立进行 4 种不同带宽的选择,可以有多达 16 种
TM

的带宽组合满足不同荧光染料的检测要求。 Synergy

Mx 专利的 4-Zone?温控系统是目前最先进的技术, 高达 65℃的孵

育温度满足所有温控实验要求,在 37℃时其温度准确性为±0.5℃。以上这些独到的设计以及 BioTek 公司在微孔板检测 系统和应用软件上所具有的高度专注,使得 Synergy Mx 成为当今生命科学研究领域拥有最好精确 度、灵敏度和灵活性的多功能微孔板检测系统。

TBS(叔丁基二甲基硅烷)

单位 u/L 表示在每升有多少 u,这个是属于一种剂量的单位,是需要根据检查的种类来做使用 的.无确定值,因物而异 MCF-7:人乳腺癌细胞系两性霉素 B: 链霉菌(Streptomycesnodosus)的培养液中分离而得的一类多烯
类抗真菌药。

光致發光(Photoluminescence,簡稱 PL) 是指物質吸收光子(或電磁波) 後重新輻射出光子(或電磁波) 的過程。從量子力學理論上, 這一過程可以描述為物質吸收光子躍遷到較高能級的激發態後返回低能態, 同時放出光子的 過程。光致發光是多種形式的螢光(Fluorescence)中的一種。
EC50,半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)是指能引起 50%最大效应的浓 度



热文推荐
猜你喜欢
友情链接: 医学资料大全 农林牧渔 幼儿教育心得 小学教育 中学 高中 职业教育 成人教育 大学资料 求职职场 职场文档 总结汇报